园艺论文_‘夏黑’葡萄组织培养、原生质体分离
文章目录
1 材料与方法
1.1 实验材料
1.2 实验方法
1.2.1‘夏黑’葡萄愈伤组织的诱导与培养基配方优化
1.2.2‘夏黑’葡萄试管苗生根诱导及培养基配方优化
1.2.3 正交实验设计
1.2.4 原生质体制备
1.2.5 原生质体的转化
1.2.6 靶位点选择
1.2.7 p GREBn-Vv ZEP植物表达载体的构建
1.2.8 数据分析
2 实验结果
2.1 不同植物生长调节剂配比对不同组织愈伤诱导的影响
2.2 不同植物生长调节剂配比对无菌苗生根诱导的影响
2.3 酶解液组合对原生质体产量的影响
2.4 不同甘露醇浓度对原生质体产量的影响
2.5 叶片原生质体与愈伤组织原生质体的形态差异
2.6 酶解时间对原生质体产量及状态的影响
2.7 抽真空时间对原生质体的影响
2.8 PEG4000浓度对原生质体转化的影响
2.9 敲除靶点的设计和p GREBn-Vv ZEP载体的构建
3 讨论
文章摘要:本研究以‘夏黑’葡萄（Vitis vinifera）为实验材料,通过调节不同植物生长调节剂浓度配比,探究‘夏黑’葡萄愈伤组织诱导及生根诱导的最适培养基,并在最适培养基条件下,以无菌苗叶片和绿色、黄绿色愈伤组织为材料,对原生质体提取及转化条件进行优化。结果表明,最适合茎段诱导芽的培养基为MS+1.0mg·L-1 6-苄氨基腺嘌呤（6-BA）+0.02 mg·L-1α-萘乙酸（NAA）,最适合茎段愈伤诱导的培养基为MS+1.0mg·L-1 6-BA+0.1 mg·L-1 NAA,最适合叶柄愈伤诱导的培养基为MS+2.0 mg·L-1 6-BA+0.1 mg·L-1 NAA,最适合叶片诱导的培养基为MS+2.0 mg·L-1噻苯隆（TDZ）+1.0 mg·L-1 2,4-二氯苯氧乙酸（2,4-D）+0.2 mg·L-1吲哚丁酸（IBA）,最适合夏黑葡萄生根诱导的培养基为1/2MS+0.5 mg·L-1 IBA。以葡萄无菌苗叶片为最佳原生质体提取材料,在纤维素浓度为30 g·L-1、离析酶浓度为5 g·L-1、果胶酶浓度为4 g·L-1、甘露醇浓度为0.6mol·L-1时, 28°C黑暗条件下酶解6 h,抽真空处理50 min后分离的原生质体最为理想。将能表达绿色荧光蛋白（GFP）的重组质粒pCAMBIA1302利用聚乙二醇4000 （PEG4000）介导法转化原生质体后,观察到强烈的绿色荧光信号,表明分离的葡萄原生质体可以用作基因瞬时表达体系;并且当PEG4000浓度为300 g·L-1时,转化效果最佳。利用CRISPR-P工具在葡萄VvZEP基因的第一个外显子中设计了2个sgRNA,通过酶切、PCR重组构建了含有2个靶标位点的靶向于VvZEP基因的CRISPR/Cas9载体pGREBn-VvZEP,为后续基因编辑载体转入葡萄原生质体提供了基础。
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